真核細胞的復雜生命活動不僅有賴于多種細胞器之間的精密協同作用，而且是各種生化參數精確調控的結果，因而具有高度的時間和空間動態特性。因此對活細胞生理過程的觀測不僅需要多目標高速成像的能力，還要求能夠對細胞內特定物化參數進行定量探測。

熒光顯微成像技術由于其特異性的標記能力以及與活體細胞的兼容性在細胞生理活動探測中廣受青睞。然而分子熒光的光譜帶寬較大（>50 nm），因此在可見光范圍內多色熒光顯微成像的目標一般于3~4個，難以滿足對活細胞復雜過程的觀測需求。另一方面，熒光生物傳感探測分子(biosensor)是實現對細胞內特定生化參數測量的主要工具。其定量測量大多依賴于探測復雜的光譜變化，所以這種定量成像與多色成像的結合對于現有的熒光顯微技術是一大挑戰。

光譜成像技術提供了解決以上問題的潛在途徑。但是一般基于熒光發射光譜的光譜成像技術往往有賴于逐點掃描來積累不同空間位置的光譜信息，因而不能滿足高速成像的需求。相比之下，熒光激發光譜可實現對寬場成像（wide-field imaging）的快速掃描，從而大大提高光譜顯微成像的速度。不過，相關研究尚不成熟，有較大局限性。

近日，加州大學伯克利分校化學學院的許可教授團隊開發出了一種熒光激發光譜顯微成像系統，實現了活細胞內多達六種細胞結構的同步動態觀測，且不同成像目標間的顏色串擾低于2%；更重要的是，該技術實現了多目標成像與定量生物傳感測量的結合，揭示了線粒體自噬過程中的多細胞器相互作用以及線粒體pH定量變化模型。

該光學成像系統的結構如圖1所示。研究人員使用具有寬帶光譜的高功率等離子光源，利用聲光可調諧濾波器（AOTF）對激發波長進行高速掃描，實現了與相機幀率同步的不同波長循環激發。

圖1. 激發光譜顯微成像系統及其對活細胞內六種結構的同時成像表征

這一設計提供了對激發波長的靈活選擇性，研究人員從而采用光譜顯著重疊的六種熒光小分子或者基因編碼表達的熒光蛋白對活細胞內進行標記（包括線粒體、內質網、溶酶體、DNA、脂肪小滴和細胞膜在內的六種目標），實現了同步、長時程動態觀測，且不同目標間的顏色串擾僅為1.3%。此外，研究人員還實現了時間分辨率達到約10毫秒的多目標成像，其成像速度僅受限于相機的幀率。

在此基礎上，研究人員揭示了一種由內質網介導的脂肪小滴的新融合機制（圖2）。

圖2. 高速激發光譜成像揭示內質網（黃色）介導的脂肪小滴（紫色）的快速融合過程

除了多目標成像之外，研究人員還將此成像系統擴展至生物傳感，進而實現對活細胞內特定參數的高時空分辨率的定量觀測。研究人員選擇了具有二重態激發光譜的pH值探測熒光蛋白（pHRed）和基于熒光共振能量轉移（Fluorescence resonance energy transfer, FRET）的大分子擁擠程度（macromolecular crowding）探測熒光蛋白對。通過對其局域激發光譜的線性解析，分別得到了線粒體基質的pH值，以及細胞質內的大分子擁擠程度在二維空間的分布圖。

通過長時程、高時空分辨率的觀測，成功揭示了線粒體基質pH突升和線粒體的形態變化的同步關系，以及活細胞內細胞質和細胞核對外界的高滲透壓和低滲透壓作用的不同反應模式（圖3）。

圖3. 基于激發光譜的活細胞pH值（左）和擁擠程度（crowding；右）的定量顯微成像

光譜成像的另一個挑戰是結合多目標成像與定量生物傳感探測。研究人員利用激發光譜成像解析了線粒體自噬（mitophagy）過程中多個關鍵細胞器和蛋白（包括線粒體、自噬體、溶酶體和Parkin蛋白）的動態特性，同時監測了線粒體基質的pH值在自噬過程中的定量變化。這一成像結果揭示了在Parkin/Pink1介導的線粒體自噬過程中不同細胞器的復雜的動態相互作用，以及線粒體pH值在這一路徑中逐漸降低的變化趨勢。

圖4. 激發光譜成像同時實現活細胞內線粒體自噬過程中的多目標成像和pH探測

總體而言，基于熒光激發光譜的顯微成像技術獨到地結合了寬場成像的優勢，具有優異的時空分辨能力；其通過光譜線性解析定量區分不同成分的能力不僅實現了多目標的高速成像探測，同時也能結合各種生物傳感分子實現生化參數的定量成像表征。在后續工作中課題組可望結合光片照明技術（light-sheet illumination）將這種定量多目標成像擴展到三維空間；或者應用結構光照明，實現超分辨定量成像。另一個潛在發展方向是開發其他具有光譜特異性的生物探針，從而結合激發光譜成像以實現對活體細胞內多種結構和功能的定量探測。