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當(dāng)前位置:上海芬創(chuàng)信息科技有限公司>>公司動態(tài)>>熒光激發(fā)光譜成像:活體細(xì)胞內(nèi)多目標(biāo)動態(tài)成像與定量探測的結(jié)合
真核細(xì)胞的復(fù)雜生命活動不僅有賴于多種細(xì)胞器之間的精密協(xié)同作用,而且是各種生化參數(shù)精確調(diào)控的結(jié)果,因而具有高度的時間和空間動態(tài)特性。因此對活細(xì)胞生理過程的觀測不僅需要多目標(biāo)高速成像的能力,還要求能夠?qū)?xì)胞內(nèi)特定物化參數(shù)進(jìn)行定量探測。 熒光顯微成像技術(shù)由于其特異性的標(biāo)記能力以及與活體細(xì)胞的兼容性在細(xì)胞生理活動探測中廣受青睞。然而分子熒光的光譜帶寬較大(>50 nm),因此在可見光范圍內(nèi)多色熒光顯微成像的目標(biāo)一般于3~4個,難以滿足對活細(xì)胞復(fù)雜過程的觀測需求。另一方面,熒光生物傳感探測分子(biosensor)是實現(xiàn)對細(xì)胞內(nèi)特定生化參數(shù)測量的主要工具。其定量測量大多依賴于探測復(fù)雜的光譜變化,所以這種定量成像與多色成像的結(jié)合對于現(xiàn)有的熒光顯微技術(shù)是一大挑戰(zhàn)。 光譜成像技術(shù)提供了解決以上問題的潛在途徑。但是一般基于熒光發(fā)射光譜的光譜成像技術(shù)往往有賴于逐點(diǎn)掃描來積累不同空間位置的光譜信息,因而不能滿足高速成像的需求。相比之下,熒光激發(fā)光譜可實現(xiàn)對寬場成像(wide-field imaging)的快速掃描,從而大大提高光譜顯微成像的速度。不過,相關(guān)研究尚不成熟,有較大局限性。 近日,加州大學(xué)伯克利分校化學(xué)學(xué)院的許可教授團(tuán)隊開發(fā)出了一種熒光激發(fā)光譜顯微成像系統(tǒng),實現(xiàn)了活細(xì)胞內(nèi)多達(dá)六種細(xì)胞結(jié)構(gòu)的同步動態(tài)觀測,且不同成像目標(biāo)間的顏色串?dāng)_低于2%;更重要的是,該技術(shù)實現(xiàn)了多目標(biāo)成像與定量生物傳感測量的結(jié)合,揭示了線粒體自噬過程中的多細(xì)胞器相互作用以及線粒體pH定量變化模型。 該光學(xué)成像系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)如圖1所示。研究人員使用具有寬帶光譜的高功率等離子光源,利用聲光可調(diào)諧濾波器(AOTF)對激發(fā)波長進(jìn)行高速掃描,實現(xiàn)了與相機(jī)幀率同步的不同波長循環(huán)激發(fā)。 圖1. 激發(fā)光譜顯微成像系統(tǒng)及其對活細(xì)胞內(nèi)六種結(jié)構(gòu)的同時成像表征 這一設(shè)計提供了對激發(fā)波長的靈活選擇性,研究人員從而采用光譜顯著重疊的六種熒光小分子或者基因編碼表達(dá)的熒光蛋白對活細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行標(biāo)記(包括線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、溶酶體、DNA、脂肪小滴和細(xì)胞膜在內(nèi)的六種目標(biāo)),實現(xiàn)了同步、長時程動態(tài)觀測,且不同目標(biāo)間的顏色串?dāng)_僅為1.3%。此外,研究人員還實現(xiàn)了時間分辨率達(dá)到約10毫秒的多目標(biāo)成像,其成像速度僅受限于相機(jī)的幀率。 在此基礎(chǔ)上,研究人員揭示了一種由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)介導(dǎo)的脂肪小滴的新融合機(jī)制(圖2)。 圖2. 高速激發(fā)光譜成像揭示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(黃色)介導(dǎo)的脂肪小滴(紫色)的快速融合過程 除了多目標(biāo)成像之外,研究人員還將此成像系統(tǒng)擴(kuò)展至生物傳感,進(jìn)而實現(xiàn)對活細(xì)胞內(nèi)特定參數(shù)的高時空分辨率的定量觀測。研究人員選擇了具有二重態(tài)激發(fā)光譜的pH值探測熒光蛋白(pHRed)和基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移(Fluorescence resonance energy transfer, FRET)的大分子擁擠程度(macromolecular crowding)探測熒光蛋白對。通過對其局域激發(fā)光譜的線性解析,分別得到了線粒體基質(zhì)的pH值,以及細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的大分子擁擠程度在二維空間的分布圖。 通過長時程、高時空分辨率的觀測,成功揭示了線粒體基質(zhì)pH突升和線粒體的形態(tài)變化的同步關(guān)系,以及活細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核對外界的高滲透壓和低滲透壓作用的不同反應(yīng)模式(圖3)。 圖3. 基于激發(fā)光譜的活細(xì)胞pH值(左)和擁擠程度(crowding;右)的定量顯微成像 光譜成像的另一個挑戰(zhàn)是結(jié)合多目標(biāo)成像與定量生物傳感探測。研究人員利用激發(fā)光譜成像解析了線粒體自噬(mitophagy)過程中多個關(guān)鍵細(xì)胞器和蛋白(包括線粒體、自噬體、溶酶體和Parkin蛋白)的動態(tài)特性,同時監(jiān)測了線粒體基質(zhì)的pH值在自噬過程中的定量變化。這一成像結(jié)果揭示了在Parkin/Pink1介導(dǎo)的線粒體自噬過程中不同細(xì)胞器的復(fù)雜的動態(tài)相互作用,以及線粒體pH值在這一路徑中逐漸降低的變化趨勢。 圖4. 激發(fā)光譜成像同時實現(xiàn)活細(xì)胞內(nèi)線粒體自噬過程中的多目標(biāo)成像和pH探測 總體而言,基于熒光激發(fā)光譜的顯微成像技術(shù)獨(dú)到地結(jié)合了寬場成像的優(yōu)勢,具有優(yōu)異的時空分辨能力;其通過光譜線性解析定量區(qū)分不同成分的能力不僅實現(xiàn)了多目標(biāo)的高速成像探測,同時也能結(jié)合各種生物傳感分子實現(xiàn)生化參數(shù)的定量成像表征。在后續(xù)工作中課題組可望結(jié)合光片照明技術(shù)(light-sheet illumination)將這種定量多目標(biāo)成像擴(kuò)展到三維空間;或者應(yīng)用結(jié)構(gòu)光照明,實現(xiàn)超分辨定量成像。另一個潛在發(fā)展方向是開發(fā)其他具有光譜特異性的生物探針,從而結(jié)合激發(fā)光譜成像以實現(xiàn)對活體細(xì)胞內(nèi)多種結(jié)構(gòu)和功能的定量探測。 |
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